線粒體提取試劑盒使用說明

 一，試劑盒組份

二，說明

線粒體提取試劑盒用于從動物細胞或組織中分離出完整而純化的線粒體。適合于動物軟組織（肝或腦組織）和硬組織（肌肉）以及培養(yǎng)細胞的線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、代謝和蛋白組學(xué)等的研究。

三，操作步驟

1. 樣本處理

a. 組織勻漿：稱取100~200 mg新鮮組織如肝臟、腦、心肌等，PBS或生理鹽水沖洗，洗凈血水，濾紙吸干，用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨組織20次；

b. 培養(yǎng)細胞勻漿：消化細胞，PBS洗滌，800 × g 5~10 min離心收集細胞。計數(shù)。每次提取需要5 × 10⁷個細胞，加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer重懸細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃勻漿器內(nèi)，0℃冰浴研磨30~40次；

2. 將組織或細胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，4℃，1000× g 離心5 min；

3. 取上清，加入一新的離心管中，4℃，1000× g 再次離心5 min。

4．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 12,000 × g 離心10 min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，線粒體沉淀在管底；

5. 在線粒體沉淀中加入0.5 mL  Wash Buffer重懸線粒體沉淀，4℃，1000× g 離心5 min；

6．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 12,000 × g 離心10 min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底；

6. 用50 -100μL Store Buffer 或合適的反應(yīng)緩沖液重懸線粒體沉淀，立即使用或-70℃保存。

四 注意事項：
1. 為保證獲得完整的線粒體，*是全程低溫操作。第二是快速。第三，在不破壞亞細胞器的情況下破碎細胞是制備線粒體的zui關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與組織塊相比，培養(yǎng)細胞特別是貼壁培養(yǎng)細胞在用玻璃勻漿器勻漿時較難破壁，因而要選用小容量玻璃勻漿器、間隙嚴(yán)密的研杵上下研磨培養(yǎng)細胞。
2. 以離心力g計算正確的離心速度，不同的離心機可據(jù)此精確計算離心速度。
3. 進行Western Blot和2D-膠電泳，可直接加入上樣緩沖液裂解線粒體。

五 儲存：四周內(nèi)使用可4℃儲存，長期置-20℃

轉(zhuǎn)速與離心力換算

G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]^２
G為離心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍數(shù)來表示；

 [rpm] ２即：轉(zhuǎn)速的平方； R為半徑，單位為厘米。