線粒體DNA提取試劑盒

 一，試劑盒組份

二，保存條件

本試劑盒整體保存于2-8度一年。使用前，在DNA酶I中加入600ul（50T）或者1100ul（100T）的DNA酶反應(yīng)液，分裝后-20度保存。線粒體裂解液使用前常溫保存，如有沉淀可37度水浴溶解，不影響使用。

三，說明

線粒體DNA提取的關(guān)鍵是盡可能的去掉核DNA。本試劑盒利用差速離心到比較純凈的線粒體，再利用DNA酶消化裂解緩沖系統(tǒng)等多步驟去掉核DNA，zui后得到純凈的線粒體DNA?？捎糜?/span>PCR等對(duì)純度要求較高的實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒用于從動(dòng)物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的線粒體。適合于動(dòng)物軟組織（肝或腦組織）和硬組織（肌肉）以及培養(yǎng)細(xì)胞線粒體DNA的提取制備。不適合植物及其他標(biāo)本的提取。

四，操作步驟

準(zhǔn)備工作：在DNA酶I中加入600ul（50T）或者1100ul（100T）的DNA酶反應(yīng)液，適當(dāng)分裝后-20度保存。線粒體裂解液保存于常溫，如有沉淀37℃水浴溶解，離心機(jī)溫度下降到4℃（2-8℃），如無低溫離心機(jī)，也可以常溫離心，并將離心時(shí)間為10min的改為5min，但zui后所得DNA品質(zhì)及產(chǎn)量可能會(huì)有一定影響。

1. 樣本處理

a. 組織勻漿：稱取100~200 mg新鮮組織如肝臟、腦、心肌等，PBS或生理鹽水沖洗，洗凈血水，濾紙吸干，用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨組織20次；

b. 培養(yǎng)細(xì)胞勻漿：消化細(xì)胞，PBS洗滌，800 × g 5~10 min離心收集細(xì)胞。計(jì)數(shù)。每次提取需要5 × 10⁷個(gè)細(xì)胞，加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃勻漿器內(nèi)，0℃冰浴研磨30~40次；

2. 將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，4℃，1000× g 離心5 min；

3. 取上清，加入一新的離心管中，4℃，1000× g 再次離心5 min。

4．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 12,000 × g 離心10 min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，線粒體沉淀在管底；

5. 在線粒體沉淀中加入0.5 mL  Wash Buffer重懸線粒體沉淀，4℃，1000× g 離心5 min；

6．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 12,000 × g 離心10 min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底；

7. 加入100ul DNA酶反應(yīng)液重懸線粒體，吹打均勻后，再加入10ul DNA酶I溶液（見準(zhǔn)備工作），混勻，37度水浴10min。此步為消化線粒體表面吸付的核DNA。4℃， 12,000 × g 離心5 min。盡可能的棄上清，再加入200ul TE 重懸線粒體沉淀，離心，洗去殘留的DNA酶。

8.得到的沉淀，用100ul TE 重懸線粒體沉淀。加入200ul線粒體裂解液，輕輕混勻（不可吹打），放置2min左右，不超過5min，再加入150ul蛋白沉淀液，迅速混勻。4℃， 12,000 × g 離心5 min。此步驟可進(jìn)一步去除核DNA。

9．取上清，加入一新的離心管中（可選用等體積的酚氯fang異戊醇25:24:1抽提一次，再用氯fang抽提一次，或者直接用氯fang抽提兩次，一般來說，此步可省，并不影響后續(xù)的PCR），加入0.6倍體積的異丙醇（如無異丙醇，可加入2.5倍體積的乙醇沉淀DNA）及10ul核酸核酸助沉劑，混勻，-20℃沉淀半小時(shí)左右（此步可?。?，4℃， 12,000 × g 離心10 min。

10. 棄上清，再加入1ml  70%乙醇，4℃， 12,000 × g 離心10 min。重復(fù)用70%乙醇洗一次。

11. 棄上清后再次離心1min 吸棄上清，開蓋涼干約5-10分鐘。

12．加入20-30ul TE緩沖液,輕彈管底，37度水浴5分鐘，線粒體DNA溶解。

13. 進(jìn)行DNA電泳檢測及-20度保存，進(jìn)行下步的實(shí)驗(yàn)。

四 注意事項(xiàng)：
1. 為保證獲得完整及盡可能多的線粒體，勻漿條件要示：*是全程低溫操作。第二是快速。第三，如用條件可將勻漿后的碎片在顯微鏡下觀察。與組織塊相比，培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞在用玻璃勻漿器勻漿時(shí)較難破壁，因而要選用小容量玻璃勻漿器、間隙嚴(yán)密的研杵上下研磨培養(yǎng)細(xì)胞。

2．線粒體DNA本身含量很低，如果電泳檢測不到，可加大上樣量，用更少量的TE溶解沉淀，或者直接進(jìn)入PCR檢測。
2. 以離心力g計(jì)算正確的離心速度，不同的離心機(jī)可據(jù)此精確計(jì)算離心速度。
 

一般低溫度心機(jī)都有離心力顯示，如果沒有，可以用以下公式簡單的換算。

轉(zhuǎn)速與離心力換算

G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]^２
G為離心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍數(shù)來表示；

 [rpm] ２即：轉(zhuǎn)速的平方； R為半徑，單位為厘米。